Üriner Sitoloji Endikasyonları ve Avantajları

Endikasyonları:

• Gross veya mikroskobik hematürili hastalar.
• Karsinojenlerle karşılaşılan asemptomatik hastalar.
• Ürotelial tümörlü olguların takibi.
• Böbrek transplantasyonlarının takibi.
  

 Avantajları:

• Düşük grade tümörlerde duyarlılığı düşüktür.
• Yüksek grade tümörlerde duyarlılığı yüksektir.
• Risk gruplarının taranmasında yararlıdır.
• Rekurrens takibinde faydalıdır.
• Sistoskopide geniş örneklenmesini sağlar.
• Üroteliumun geniş örneklenmesini sağlar.
• Non-invaziv ve ucuz bir yöntemdir.

Üriner Sistem Sitolojisi

Örnekler:

• Spontan İdrar
• Kataterize İdrar
• Mesane Yıkama Sıvısı
• Fırçalama
• Yapay mesane idrar örneği

Respiratuar Sistemde en sık görülen Hücreler

1. Psödötrastifiye Silialı Kolumnar Hücre:  Ekzantrik nukleus, ince granuler kromatin silia, 1 veya 2 nukleol, prizmatik kolumnar hücreler
2. Goblet Hücreleri: Mukus üreten bronşiyal hücrelerdir. Kronik hastalıklarda sık görülür. Sitoplazmada vakuol vardır. Sigara içenlerde ve kronik a.c hastalıklarında sayısı artar. İrritasyon nukleer genişleme , kromatin yoğunlaşması, multinukleasyon.
3. Alvoel ve Terminal Bronşiallerden Dökülen Hücreler: Çok az görülür. İzoledirler, yuvarlak tek hücreler, irritasyon durumlarında multinukleasyon olabilir. İnce vakuollü sitoplazma santral nukleol,1-2 nukleolus.
4. Skuamoz Metaplazik Hücreler: Sigara içenlerde görülebilir.
5. Reserv Hücre Artışı

Solunum Sistemi Enfeksiyonları/ Respiratory Tract İnfections

1. Viral Enfeksiyonlar(İnfections): Herpes simplex, sitomegalavirüs,adenovirüs, Sinsityal virüs.
2. Bakteriyel Enfeksiyonlar (İnfections): Mycobakterium, actinomices,leigonella (klimaya bağlı hastalıklarda) nocardia. AIDS
3. Fungal Enfeksiyonlar(İnfections): Kriptokokus, histoplazmozis, asperglozus
4. Paraziter Enfeksiyonlar(İnfections):

• Pnömosistis Carini: İmmün yetmezliğinde sık görülr. BAL ile gösterilir. PAP ile görülmez. Gümüş boyaları ile gösterilir.
• Stronyloidiazis
• Ekinokokus (hidiatik hastalık)

Solunum Sistemi Sitolojik Materyalleri

1. Balgam
2. Bronşial Materyal (lavaj, Bronşial aspirasyon ve yıkama sıvısı)
3. Transbronşial ince iğne aspirasyonu
4. Transtorasik ince iğne aspirasyonu

• Balgam: Hücresel ve hücresel olmayan elemanlar karışımıdır. Sabahları aç karnına derin öksürük ile alınmalı, eğer hasta çıkaramıyorsa ekspektorasyon tuzlu su buharı ile güçlendirilebilir. Yeterlilik kriteri aloveoler makrofaj bulunmasıdır. Yayma santrifüj, thin prep, hücre bloğu ile çalışılır.
• Bronşial Aspirasyon ve Yıkama: Bronkoskobi ile materyal sağlanır. Materyal taze hemen sitolojiye gönderilmelidir. Makroskobi santrifüj, sitosantrifüj,hücre bloğu ve thin prep ile çalışılır. Bronkoskop ile materyal alınır.
• Bronkoskobik Lavaj: 3-5 ml tuzlu solüsyon veya Serum Fizyolojik ile yıkanmalı. Fiksasyon %95 lik etanol ile yapılmalıdır.
• Transbronşial İnce İğne Aspirasyon: Akciğer lezyonlarının tanısında faydalıdır. Bronkospiye göre düşük maliyetlidir.
  Komplikasyonu= endobronşiyal kanama, kontrendikasyonu-koagülasyonu-koagülopati, solunum yetmezliği görülebilir.
• Transtorasik İnce İğne Aspirasyonu: Endikasyonu : kitle varlığı. Komplikasyonları: Pnömotoraks, hemoptizi, hava embolisi, tümör ekimi

Vücut Boşlukları Sitolojisi

  Mezotelial Hücreler: Dağınık ve izoledir. Windows (+), yuvarlak hücre, yuvarlak nukleus, tek nukeolus, ektoplazma ve endoplazma ayrımı (+)

1. Primer Tümörler
   
   Mezotelioma denir.'' oma '' eki almasına rağmen maligndir. Daha çok plevrada görülür. Plevrada kitle oluşumu ile başlar, hasta nefes alamaz. Her yaş grubunda görülebilir. En sık 30-60 yaş arası erkeklerde biraz daha sık rastlanır. Asbest ile ilgilidir. TRU-CUT biopsi tercih edilir. Effüzyon sıvılarında ortaya çıkar. Özellikleri;
   
   *Büyük kümeler
   *Sitomegali
   *Yuvarlak santral nukleus
   *Belirgin nukleolus
   *Binukeasyon ve multi nukleasyon
2. Sekonder Tümörler

• Adenokarsinom Metastazları:  İlk sırada görülür. Erkeklerde akciğerde plevrada, kadınlarda meme,peritonda barsak metastazları görülür. Adenokarsinomda;
  
  *Sitoplazmik vakuolizasyon,
  *Taşlı yüzük hücreler
  *Tek veya kümeler
  *En önemlisi psammom body görülür.
• Skuamoz Karsinom:  PAP ile orangofilik boyanan keratinize veya non-keratinize dens sitoplazmalı hücreler
• Küçük Hücreli Karsinoma: Lenfositlerle karıştırılarak yanılgıya yol açabilirler, dikkatli olunmalıdır.
• Lenfoma 
• Diğerleri

Hodgkin Lymphoma

     An indolent B-cell lymphoma that usually presents in supradiaphragmatic areas (above the diaphragm such as supraclavicular lymph nodes or Anterior Mediastinum). There is a bimodal age distribution (most patients present in their 20s and 50s). Four main subtypes are: Nodular Sclerosis, Mixed Cellularity, Lymphocyte-rich, and Lymphocyte-depleted. The hallmark of all Classical Hodgkin lymphomas is the Reed-Sternberg cell (RS cell) which usually have the following immunophenotype: diim PAX5+, CD30+, CD15+,CD20-,OCT2-,and BOB1-.

Bedhesda Sistemi

• Yeterlilik
• Tanı
• Açıklayıcı tanı
• Hormonal değerlendirme

1. Yeterlilik Kriterleri:
   
   * Endoservikal hücre sayısı
   * İyi fikse, iyi korunmuş, iyi yayılmış lam (okunabilen skuamoz hücre sayısı)
   * Klinik bilginin eksiksiz olarak yazılması (SAT,kontrasepsiyon, yaşı, kürtaj, doğum ve abortus sayısı)
   * Yeterli, yeterli-sınırlı, yetersiz (thin prep)
2. Tanı Kriterleri:
   
   * Negatif normal pap-smear
   * Negatif bening hücre değişiklikleri (Rutinde en sık görülen gruptur.)
   * Normal dışı değişiklikler (pozitif pap-smear)
   * Yetersiz pap-smear

Endokrinopatiler

 Hormonal patolojiye endokrinopati denir. 2ye ayrılır.

• Primer amenore ile ilgili endokrinopati=18 yaşına kadar mens olmuyorsa.
• Sekonder amenore ile ilgili endokrinopati= reptodüktüf dönemde herhangi bir sebeple görülür.

            Primer Amenore Nedenleri:

1.    Turner Sendromu (45X0): Hirsutizm denilen aşırı kıllanma köşeli yüzlü kısa boylu parmaklar perdeli ya da fazla sayıdadır. Tanıda bukkal smearde barr cisimciği tayini yapılır. Normalde %30 barrcismi görülmesi gerekirken bu hastalarda %10-12 nin altındadır. Başka içi organ anomalileri de vardır. Atrofik smear görülür. IQ düşüktür.
2.   Testicular Feminizasyon (45XXY) : Hirsutizm vardır. Kalın sesli ekstremiteleri uzun erkeksi hastalardır. Atrofik smear görülür.
3.   Hermafrodizim: Her iki cinse ait üreme organları vardır. Östrojen ve progesteron ve androjen hormonlarının etkisi söz konusudur. Erken yaşta tesbit edilirse kişinin ve ailenin eğilimine göre uygun hormon replasmanı ve cerrahi girişimle belli bir cinse yönlendirilebilir.
4.  Pituiter İnfantizm: Pituiter-hipofiz bezin yeteri kadar gelişmemesi ile olur. IQ düşük ve küçük kafalı kısa boylu hastalardır. FSH LH yoktur. Östrojen ve progesteron eksikliği vardır.
5.  Uterus Aplazisi: Gebeliğin ilk timestrinde geçirilen viral enfeksiyonlara bağlı olarak uterusun gelişmemesidir. Doğal olarak amenore görülür.
6. Adrenal Gland Aplazisi : Gelişim anomalisi nedeniyle adrenal bez gelişemez ve amenore olur. Atrofik smear vardır.

          Sekonder Amenore Nedenleri

 A) Fizyolojik Sebepler

• Hamilelik
• Menapoz
• Laktasyon

 B) Patolojik Sebepler

1. Ovaryum Kaynaklı Hormon Üreten Tümörler: Özellikle menapozdan sonra görülür. Amenoreye sebep olduğu için bayanlar menapozla karıştırabilir. Tümör androjen salgılar ve prognozu kötüdür.
2. Anoreksiya Nevroza: Anoreksiya nevroza da zaman zaman amenoreye sebep olabilir.
3. Hipertiroidizm: Genç bayanlarda görülür. Troid hormon seviyesi normalde döndürdüğünde menstruel siklus devam eder.
4. Tümörler: Bazı tümörlerin oluşumu amenoreye sebep olur.
5. Hipofiz ve Hipotalamus Bozukluğu: Amenore dışında meme başında galaktore adı verilen laktasyon dışı zamanda süt salgısı olur.
6. Ovaryum- Endometrium: Amenore dışında, meme başında ''galaktore'' adı verilen laktasyon dışı zamanda süt salgısı olur.
7. Stein- Leventhal Sendromu: Repredüktif dönemdeki bayanlarda ovaryumlar polikistiktir. Kilosu fazla hastalardır. İnfertiliteye neden olur. Tedavide ovaryuma kistik rezeksiyon yapılır.

Lymphoplasmacytic lymphoma

  An indolent B-lymphoma which is characterized by small-intermediate sized neoplastic lymphocytes and plasma cells. Often associated with Waldenstrom Macrogrammaglobulinemia (usually showing an increased amount of clonal lgM by serum protein electrophoresis and lmmunofixation Electrophoresis).

Lymphoma

  A neoplastic malignancy of lymphoid origin that involves some tissue (e.g. Lymph node, Spleen, Liver, Stomach). The T-cell and NK cell lymphomas are typically Non Hodgkin lymphomas white B-cell lymphomas can be either Non-Hodgkin or Hodgkin lymphomas.

Ampiyem

   Plevranın iltihabik durumudur. Nötrofil lökositler görülür.TBC de ise lenfosit vardır.İdiopatik eosinofilik plörezi sebebi bilinmeyen dir. Effüzyon sıvılarının esas hücreleri mezotel hücreleridir. 2. makrofaj yan yana durunca ortada WİNDOW oluşur. Nedeni mikrovilluslardır, mikrovilluslar yüzünden hücreler sırt sırtadır. Ektoplazma içteki ektoplazmadır. (cleft=yarıktır).

Endoservikal Kolumnar Hücre

• Sekretuvar-sıralı (tubal metaplazi) = ikisi sık görülür.
• İntercalated (kadeh) hücre
• Tek tek, sheet tarzında veya poligonal bal peteği tarzında görülür.
• Sitoplazma siyanofiliktir.
• Nukleus intermediate hücre nukleusunun 1/2-2 katıdır.
• Yuvarlak oval nukleusludur.
• Kromatini ince granülerdir.
• PAP ile siyanofiliktir, HE ile eozinofiliktir.

 * Normalde endometrial hücreler menstrüel siklusun ilk 10 gününde görülür. Bunun haricinde görülmesi patolojiktir.

• Smear; poliferasyon döneminde alınmışsa= superficial hücre görülür= FSH ve Östrojen etkindir.
• Smear: sekresyon döneminde alınmışsa = intermediar hücre görülür= LH ve Progesteron etkindir
• Östrojen; superficial hücre LH da intermedier hücre artışına neden olur. Kadınlarda azda olsa androjen hormonu bulunur. Androjen hormonu hem superficial hemde intermedier hücre artışına neden olur.
• ERT: Östrojen replasman tedavisi bununla beraber superficial hücre oluşumu görülür.

Skuamoz Metaplazik Hücre

• Rezerv hücre hiperplazisi
• Bazal (rezerv) hücrelerin artışıdır.
• İrregüler, polygonal, küçük hücrelerdir.
• Sitoplazma syanofiliktir ve küçük vakuoller vardır.
• Nukleuslar yuvarlak-oval bazen reniformdur.
• Kromatinde ince granüller ve küçük kromosenter vardır. Nukleol yoktur. Çok sıkı tutunma vardır.

1. Matür          
2. İmmatür

• İmmatür metaplazide sitoplazmada vakuoller görülür.
• Rezerv hücrelere göre büyük ve polygonaldirler.
• Birbirlerine köşelerinden ve koheziv (gevşek) tutunurlar.
• Matür skuamoz metaplazide ayrı dururlar, izole.
• Siyanofilik ve dens sitoplazma vardır.
• Hücre sınırları belirgin değildir.
• Oval-yuvarlak-santral nukleus vardır.

    Atrofik Skuamoz Hücre:

• Yuvarlak-oval sınırlıdır.
• Poligonaldir.
• Menapoz döneminde görülür.

Skuamoz Hücreler

  Çok katlı yassı epitel 4 tabakalıdır.

1.  Bazal hücreler = bazal membran da yer alır.
2.  Parabazal hücreler = bazal membranın üzerindeki hücrelerdir.
3.  İntermediate hücreler
4.  Süperfisyel hücreler 

            Süperfisial Skuamoz Hücreler;

• Ekzoserviks ve vajinadan gelen hücrelerdir.
• En üstte yer alır.
• Östrojen hormonu etkisindedir.
• Kornifiye (boynuzsu) ve ya karyopiknotik adlarını da alır.
• Polygonal şekilli, küçük dens nukleuslu
• Hücre sınırları keskin belirgin
• Sitoplazma ince-transparan
• PAP ile eosonofilik-siyanofilik sitoplazma
• Hücre katlanmaları az hücre tipidir.
  
    İntermediate Skuamoz Hücreler;
  
• Parabazal üzerinde yer alırlar.
• %90 polygonal şekillidirler.
• Sitoplazma eosinofilik, siyanofilik de olabilir.
• Nukleusu süperfisyelin 2-3 katıdır.
• Kromatini ince ve granülerdir.
• Progesteron hormonunun etkisi altındadır.
• Hamilelikde naviküler hücre
• Sitoplazmik katlanmaları sıktır.
• Ortalama 212 mm2
• Relaktif nükleer alan süperfisyel hücrelerde %2-3, intermediate hücrelerde %13-15dir.
  
    Anükleer Skuamoz Hücre;
  
• Nukleussuz skuamoz hücredir.
• Sitoplazması eosinofilik veya oranjofiliktir.
• NSA tek tük bulunur.
• Sayıca artışı PROLAPSUS DECENSUS un işaretidir. Bu ligamanlarda aşınma sonucu stratifiye çokkatlı yassı epitelin anükleer hücrelere dönüşümü dür.
  
   Parakeratotik Hücre;
  
• Nukleus piknotik
• Sitoplazma oranjofilik
• Superficial ve anükleer akuamoz hücre ara tipidir.

Jinekolojik Sitoloji

  Terimler:

• Puerperium: lohusalık
• SAT: son adet tarihi
• RIA=IUD: intrauterin device
• Metroraji: Adet dışı kanama
• Hipermenore: 21 günden sık adet görme
• Hipomenore: 28 günden daha uzun sürede adet görme
• Oligomenore: Miktarının az olması
• Polimenore: Miktarının fazla olması
• Dismenore: ağrılı adet görme
• Lökore: vajinal akıntı
• Disüri: Ağrılı idrar yapma
• ERT: östrojen replasman tedavisi
• Reprodüktif dönem: puberteden menopoza kadar olan dönemdir,üreme dönemi
• Klimakterium dönemi: Premenopozal dönemle post menopozal arası dönem
• Senilite: Yaşlılık dönemi post menopozal dan sonra
• Proliferasyon Dönemi: primordiyal follikül (yeni doğan kız çocuğunda) = sekonder follikül (bir adet promordiyal follikül seçilir) = 14.günde FSH düşer LH yükselir ovum atılır = korpus luteum
• Sekresyon Dönemi: korpus luteum= korpus albikans = korpus fibrozum (gebelik olmazsa) korpus luteum= korpus desidua=korpus hemorajikum (gebelik gerçekleşirse)

Hücre Bloğu

      Yeterli sıvı-çökelti bulunan her sıvı materyal için,mutlaka hücre bloğu hazırlanmalıdır. Özel tekniklerin  uygulanabilmesi için, uygun fiksatif içinde fikse edilmesi önerilir. Hücre bloğu hazırlamanın çeşitli yöntemleri  vardır.

•   Plazma-Trombin Yöntemi:
   Fikse edilmemiş çökeltilere uygulanabilir. Önceden fikse edilmiş sıvıların çökeltilerinin birçok defa fizyolojik-dengeli elektrolit çözeltileri ile yıkanması gerekir. Çökeltiye birkaç damla plazma damlatılır, karıştırılır, aynı miktarda trombin damlatılır, 10 dakika yumuşak bir pıhtı oluşur, en az yarım saat fikse edilir ve lens/ filtre kağıdına sarılıp,kasetlenerek doku takibine alınır.
  

Sitoloji

    Sitolojik materyallerin incelenmesi patoloji bölümünün rutin hizmetinin bir parçasıdır.
 Sitolojik materyaller şu ana başlıklarda incelenebilirler.

  Patoloji bölümünde elde edilenler:

• İnce iğne aspirasyonu materyalleri
• Fikse edilmemiş dokulardan hazırlanan dokundurma ve ezme yaymalar

  Klinik doktorunun hazırlayıp gönderdiği yaymalar;

• Jinekolojik yaymalar
• Diğer yaymalar ( fırça sitolojisi ve ince iğne aspirasyonu yaymaları)

  Çeşitli vücut bölgelerine ait eksfoliyatif sitoloji ve aspirasyon materyalleri;

• Fikse edilmeden gönderilen sıvılar
• Fiksatif içinde gönderilen sıvılar

1.  Patoloji bölümünde elde edilen; ince iğne aspirasyon yaymaları; Dokundurma ve ezme yaymalar, %95 etil alkolde fikse edilip Papanicolaou yöntemi ile boyanır. Havada kurutulmuş yayma hazırlanır ise, Giemsa,Diff Quick gibi hematolojik boyalar ile boyanır veya immünhistokimya gibi ek teknikler için bozdolabında saklanır.
   
2. Klinik doktorunun hazırlayıp gönderdiği yaymalar; Kemik iliği aspirasyonu yaymaları gibi, özellikle havada kurutulmuş olarak gönderilmesi gerekenler dışında,klinik doktorun hazırlayıp gönderdiği yaymaların fikse edilmiş olması istenilir. Yaymaların hazırlandığı anda fiksatife atılması gerekir. En sık kullanılan fiksatif %95lik etil alkoldür.
   
3. Çeşitli vücut bölgelerine ait eksfoliyatif sitoloji ve aspirasyon materyalleri; Eğer olanak varsa tüm materyallerin,hemen,fiksasyonsuz olarak laboratuvara getirilmesi uygundur.Buzdolabında saklanması koruyucu etkisini uzatabilir.

Patoloji Laboratuvarında Uyulması Gereken Kurallar

• Laboratuvar çalışmasına başlamadan önce çalışma planlamalıdır.
• Laboratuvar her zaman düzenli olmalıdır.
• Laboratuvar toz,nem,buhar,elektromanyetik etken ve zararlı biyolojik etkenlerden korunmalıdır.
• Laboratuvarın aydınlanma sistemi ihtiyacı karsılamalı ve bakımları düzenli aralıklarla yapılmalı.
• Laboratuvardaki ısınma sisteminin periyodik olarak bakımları yapılmalı.
• Laboratuvardaki elektrik sistemi kontrolleri sık sık yapılmalı ve belirli aralıklarla yenilenmelidir.
• Laboratuvarda olabilecek kazalara karşı ilk yardım için gerekli malzemeler her zaman hazır, eksiksiz ve ulaşılması kolay olan bir yerde muhafaza edilmelidir. Personel bu konuda eğitilmelidir.
• Personelin iş güvenliğini sağlayacak gerekli malzeme ve donanım bulundurulmalıdır.
• Kullanılan eşya,alet ve malzeme işi bittikten sonra tekniğine uygun olarak temizlenmeli ve yerine kaldırılmalıdır.
• Laboratuvarda yapılacak temizlik, dezenfeksiyon ve sterilizasyon işlemleri belirli aralıklarla belirli kurallara uygun olarak düzenli bir şekilde yapılmalıdır.
• Laboratuvarın giriş çıkışı denetlenmelidir.
• Çöpler ayrılmış özel atık kutularına atılmalı; tıbbi atıklar ve diğer atıklar ayrı ayrı atık kutularına atılmalı ve daha sonra uygun şekilde imha edilmelidir.
• Laboratuvardaki dolapların üzerinde o dolabın içinde nelerin bulunduğunu gösteren bir etiket bulunmalıdır.
• Katı haldeki maddeler alınırken asla elle alınmamalı temiz bir spatül yardımıyla alınmalı. Kirli spatül başka bir maddeye bulaştırılmamalıdır.
• Tuvaletler laboratuvar ortamından uzak bir yerde olmalıdır.
• Laboratuvarda olabilecek kazalara karşı yalnız başına çalışılmamalıdır.
• Laboratuvardan çıkmadan önce mikroskop lambaları kapatılmalıdır.

Pap (Papanikolau) Boyama Tekniği

 Sitolojik preparatlarda uygulanan bir boyama tekniğidir.

  • Preparatlar %70 lik alkolde tespit edilir.

  • Akarsuda 1-2 dk yıkanır.

  • Hematoksilen boyada 10 dk bekletilir.

  • Akarsuda 1-2 dk yıkanır.

  • Alkolde 1-2 dk bekletilir.

  • Orange G boyada 5-10 dk bekletilir.

  • Akarsuda 1-2 dk yıkanır.

  • Alkolde 15 sn bekletilir.

  • EA-50 boyada 5-10 dk bekletilir.

  • Akarsuda 1-2 dk yıkanır.

  • Alkolde 1-2 dk bekletilir. Kurutulur.

  • 10 dk ksilolde bekletilir.

  Not: Yukarıdaki bilgiler hastaneden hastaneye ve boya kalitesine göre değişiklik gösterir. (Örn: boya daha kaliteli ve yeni kullanıma başlandıysa boyada bekletilme süreleri daha kısalır).

Hematoksilen-Eozin Boyama Tekniği

  • Deparafinizasyon İşlemi tamamlanmış kesitler etüvden çıkartılır.

  • 1. Ksilol de 20 dk bekletilir.

  • 2. Ksilol de 20 dk bekletilir.

  • 1. Alkol de 20 dk bekletilir.

  • 2. Alkol de 20 dk bekletilir. ( ve akarsuda 1 dk bekletilir.)

  • Hematoksilen boyada 5-10 dk bekletilir.

  • Akarsuda 1-2 dk bekletilir.

  • Asit alkolde 10 sn bekletilir.

  • Akarsuda 1-2 dk bekletilir.

  • Eozin boyada en az 1 dk en çok 5 dk bekletilir.

  • Akarsuda  1-2 dk bekletilir.

  • 4 tane alkolde sırası ile 30 sn periyotlarla geçirilir.

  • Temiz ksilolde en az 20 dk bekletilir.(Saydamlaştırma)

  • Kurutulup kapatma işlemi uygulanır.

  Not: Yukarıdaki bilgiler hastaneden hastaneye ve boyanın kalitesine göre değişiklik göstermektedir.

 

Doku Kompenentlerinin İyonizasyonu (Boyanmalarına göre Hücreler ve ya Dokular)

  Bazik (+)

• Kollojen
• Eritrosit
• Eozinofillerin Granülleri

  Asidik (-)

• DNA,Kromatin
• RNA
• Miyelin,kıkırdak
• Mukoz salgılar
• Mast Hücre Granülleri

  Amfoterik

• Sitoplazma
• Kas

Boyaların Yapıları

  Quinonoid Boyalar

• Asit ve Bazik Fuksin
• Kristal Viyole
• Anilin Blue
• Eozin
• Thionin
• Metilen Blue
• Nötral Red
• Doğal boyalardan hematein ve karminik asit.

  Azo Boyalar

• Orange G
• Congo Red
• Trypan Blue

  NitrQ Boyalar

• Pikrik Asit (trinitrofenol)
• Aurantia

Boyama İşlemleri

         1) Vital Boyama

• Partiküllerin fagositozu
  
  Belirlediği yapılar: Makrofaj sistemi
  Kullanılan yer: Canlı Dokular
  Hangi boya: Trypan mavis
  
• Canlı Yapıların Spesifik Boyanması
  
  Belirlediği Yapılar: Mitokondri
  Kullanılan Yer: Canlı Hücreler
  Hangi boya: Janus Green
  
  2)Seçilen Çözünebilirlik
  
  Belirlediği Yapılar: Yağ damlacıkları
  Kullanılan Yer: Dondurma Kesitler
  Hangi Boya: Sudan boyaları gibi lizokromlar
  
  3) Renkli kimyasal maddelerin yapımı
         
• Stabil Bileşikler
  
  Belirlediği Yapılar: Ferrik Demir
  Kullanılan Yer: Tüm Kesitler
  Hangi Boya: Perls Yöntemi
  
• Stabil olmayan bileşikler
  
  Belirlediği yapılar: Enzimler
  Kullanılan yer: Özel hazırlanmış kesitler
  Hangi Boya: Histokimyasal Yöntemler
  
  4) Metal Çöktürme
  
• İntrasellüler yapılar
  
  Belirlediği yapılar: Melanin
  Kullanılan yer: Tüm Kesitler
  Hangi Boya: Fortana gümüş
  
• Fibriller
  
  Belirlediği yapılar: Reticulin
  Kullanılan yer: Tüm Kesitler
  Hangi Boya: Gümüş Yöntemi

       5) Boyalarla Boyama

• Genel Kimyasal ve Fiziksel Hareketler
  
  Belirlediği yapılar: Doku yapıları
  Kullanılan yer: Tüm Kesitler
  Hangi Boya: Hematoksilen Eosin
  
• Metakromazi
  
  Belirlediği yapılar: Kıkırdak,amyloid
  Kullanılan yer: Tüm Kesitler
  Hangi Boya: Thionin,crystal violet
  
• Bir boyanın Lokal Şekillenmesi
  
  Belirlediği yapılar: DNA
  Kullanılan yer: Parafin Kesitler
  Hangi Boya: Feulgen Reaksiyonu   

Doku (hücre) Boyanmasının Tarihi

      Dokuları boyamak için ilk girişim, Leuwenhoek (1719) tarafından safran kullanılarak yapılmıştır. Bu girişim başarılı olmadığı gibi diğer araştırıcılar tarafından da takip edilmemiştir.
 

      19.yy ortalarında dokuların mikroskobik yapıları ayrıntılı olarak açıklanmaya başlanmıştır (Kölliker,1852). Bu dönemde boya endüstrisi gelişmiştir. Histolojide ticari boyaların uygulanması, önceden görülemeyen hücresel yapı detaylarını saptamayı, görülmesini ve çalışılmasını sağlamıştır. Boya teknikleri son yüzyılın ikinci yarısında gelişmiştir ve birçok yöntem ozamandan beri çok az değişikliğe uğramıştır. İki botanikçi ilk kez Carmin boyama yöntemini tanıtmışlardır ancak bu yöntemle sadece dokuların hafifçe renklenmesini sağlayabilmişlerdir. Seçici çekirdek boyamasının ilk kullanımının, sinir hücreleri boyamaya çalışan Gerlach (1858) tarafından yapıldığı kabul edilmektedir. Başlangıçtaki başarısızlıktan sonra potasyum bikromatta sertleştirilen bir cerebellum kesiti yanlışlıkla fazlasıyla seyreltik amonyaklı carmin solusyonunda bırakılmış ve 24 saat sonra bulunduğunda çok güzel boyanmış olduğu sinir fibrilleri ve sinir hücrelerinin ayrılabildiği görülmüştür. Gerlach aynı zamanda zayıf asetik asitle differansiyonla gerileyen (çekinik) boyanmayı da keşfetmiştir. Hematoksilen ilk kez yetersiz sulu ekstrak olarak kullanılmıştır. Fakat iki yıl sonra Böhmer (1865), hematoksileni bir mordant olarak alumla (şapla) karıştırmış ve daha spesifik boyanma elde etmiştir. Eski boya yöntemleri günümüzdede hala kullanılmaktadır.

Kesitlerin Boyanması

     Boyanmış preparatlar da çoğu doku elemanları renksizlerdir. Değişik kırma indekslerine sahip olmaları nedeniyle ışık mikroskobu ile hücresel detayı görmek güçtür. Farklı morfolojik kısımların, farklı boyalarla boyanması gereklidir.Bu durumda çekirdek sitoplazmadan, kas bağ dokusundan farklı boyanarak,morfolojik inceleme kolaylaşır. Boyalar histokimyasal işlemlerle, dokuların kimyasal reaksiyonlarını ortaya koyar.

    Genel olarak kesitler iki boya ile boyanırlar. Bazik ve asit boyalarla boyanan kesitleri mikroskop altında incelediğimizde bazik ve asit boyaların bazı doku elemanlarını boyadıkları görülür. Bazik boya ile boyanan doku elemanları 'bazofilik' asit boyalarla boyananlar ise ''asidofilik'' olarak adlandırılırlar. Bazı doku elemanları bazik, bazıları ise asit boyaları tutmaktadır. Genel olarak kullanılan bazik boyalar doku elemanları ile mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renk verirler.

   Boyalar sulu solüsyon içinde anyon ve katyonlara ayrılırlar. Boyaların renk verme kabiliyeti,anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya bazik (katyonik) , anyonda ise asit (anyonik) bir boyadır.

   Boyaların doku elemanlarına bağlanma mekanizması genel olarak böyledir; Doku kesitlerindeki protein,lipoprotein ve glikoproteinler amphoteric'tirler. Yani pH'ya ve çevrelerindeki çeşitli diğer şartlara bağlı olarak iyonize olabilirler. Bir protein,sahip olduğu elektrik yüküne ve boyanmanın meydana geldiği pH'da geldiği (-) ve (+) yüklerin cebirsel toplamına bağlı olarak asit veya baz olarak hareket eder. Bu her iki tür proteinin (-) ve (+) yük sayılarının eşit olduğu bir pH vardır. Bu pH' ya o proteinin izoelektrik noktası denir. Bu pH' da o protein çok az bulunur. Fakat izoelektrik noktanın üstünde proteinin anyonik gruplarının iyonizasyonu kolaylaşır ve protein,metilen mavisi veya bazik fuksin gibi bazik boyalarla bağlanır. Bu izoelektrik noktasının altında, aynı protein ,pozitif yüke sahiptir ve bu durumda eosin, orange G veya light green gibi asidik (anyonik) boyalarla birleşirler. Dokulardaki proteinlerin amino asitleri nisbi miktar bakımından oldukça farklıdırlar ve farklı izoelektrik noktalarına sahiptirler. Dolayısıyla histolojik boyama için kullanılan mutat pH'da , bazı elemanlar daha çok bazik boyaları alarak bazofilik, bazıları ise aynı pH'da asit boyalarla asidofilik olarak boyanır.

   Alyuvarlar, eosinofilik lökositlerin granülleri ve midedeki parietal hücrelerin sitoplazmaları pH 6'da asit boyalarla boyanırlar. Buna karşılık çekirdek kromatini sinir hücrelerinin sitoplazmaları ve kıkırdak dokusunun ara maddesi ise bütün bazik boyalarla boyanmaktadır.

Kesit İşleminde Oluşabilen Problemler ve Artefaktlar

1)Eğri Kesit
   Nedenleri:
       *Blok paralel traşlanmamıştır.               
       *Bıçak ağzı düzensizdir.
   Çözümleri:
        *Blok paralel olana kadar traşlanmaya devam edilir veya yeniden gömülür.
        *Bıçağın başka kenarı ile kesilir.
2)Değişen Kalınlıkta Kesitler
   Nedenleri:
        *Kullanılan parafin çok yumuşak olabilir.
        *Blok veya bıçak sıkıştırması yetersiz.
        *Mikrotom mekanizmasında aksaklık.
   Çözümleri:
         *Blok buz ile soğutulur veya daha yüksek erime derecesine sahip parafine tekrar gömülür.
         *Blok veya bıçak sıkıştırılır.
         *Bilinen ayarlar kontrol edilir.
3)Bıçak Ağzında Kesitlerin Sıkışıp Büzüşmesi
   Nedenleri:
       *Bıçak kör olabilir.
       *Blok veya bıçak sıcak olabilir.
       *Bıçak açısı dar olabilir
       *Kesit çok incedir.
    Çözümleri:
        *Bıçak değiştirilir.
        *Soğutulur
        *Açı arttırılır
        *Daha kalın kesit alınır.
4)Kesitlerin Parçalanması ve Dokunun Ufalanması
    Nedenleri:
        *Yetersiz dehidrasyon,şeffaflandırma veya infiltrasyon.
        *Gömme ve infilitrasyon esnasında  parafin çok sıcak olabilir.      Çözümleri:
        *Dokular yeniden takibe alınır
        *Parafin banyosunun ısısı hergün kontrol edilir.
5) Parafin Şeritte Yarılma veya Uzunlamasına Çizikler
      Nedenleri:
       *Bıçak ağzı kirli olabilir.
       *Bıçak kör veya çentikli olabilir.
       *Doku parafine göre çok sert olabilir.
       *Dokuda sert partiküller olabilir.(tel vs.)
      Çözümleri:
        *Bıçak değiştirilir.
        *Kullanmadan önce temizlenir.
        *Selloidine gömme önerilir.
        *Kalsiyum ise dekalsifiye edilir, diğer partüküller dokudan uzaklaştırılır.
6)Kesitlerin Bıçaktan Kalkması
     Nedenleri:
         *Bıçak açısı diktir.
         *Bıçak kirli
     Çözümleri
         *Açı arttırılır.
         *Temizlenir.
7) Su Banyosunda Kesitlerin Dağılması
     Nedenleri:
         *Yetersiz infiltrasyon,yumuşak veya yağlı doku.
     Çözümleri:
         *Kesitler lama çok hızlı alınır veya su soğutulur.                              

Kesit İşlemi Aşamaları

• Blok Soğutma
• Bıçağı tutucuya sabitleme ve bıçak açısı ayarlama
• Blok sabitleme
• Blok traşlama
• İnce Kesit Alma (3-5 mikron)
• Kesiti suya bırakma
• Kesiti lama alma
• Lamı deparafinizasyon için sepete dizme.

Mikrotom Bıçakları

                        

1. Çelik Bıçaklar
   
   *İyi kalite karbon veya ısı ile sertleştirilmiş çelikten oluşur.
   *Çeliğin yapısı; temiz,paslanmaz, anti-korozivdir.
   
2. Non-Koroziv ve Korozyona Rezistan Bıçaklar
   
   *Frozen ve kriyostat kesit için uygun
   *Kobalt veya krom bıçaklardır.
   
3. Disposable Bıçaklar (Tek Kullanımlık Bıçaklar)
   
   *Günümüzde en yaygın kullanılan bıçak tipidir.
   *Kesit kalitesi çok yüksektir.
   *Paslanmaz çelik bıçaklardır.
   *Bıçak ağzı,platin ve krom ile kaplıdır.
   *Bıçak ağzı teflon ile kaplı olanların kullanımı kriyostat için uygundur.
   
4. Tungsten Karbid Bıçaklar
   *Yüksek kalite non korroziv tungsten karbit.
   *Bıçak suya rezistan,aşırı sertlik nedeniyle kırılgandır.
   *Metakrilata gömülmüş dekalsifiye olmayan kemikten seri kesit alınmasını sağlar.
   
5. Cam Bıçaklar
   
   *Ultramikrotomda kesit için uygundur.
   *Işık mikroskobunda parafin ve reçine kesitlerinde 'Ralph' tipi cam bıçaklar uygundur.
   *Kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
   
6. Elmas Bıçaklar
   
   *Pahalı ve uzun ömürlü bıçak tipidir.
   *Epoxy reçine gibi sert gömme ortamlarının kesimi için uygundur.
   
7. Safir Bıçaklar
   
   *Tungsten karbid ve cam bıçaktan daha serttir.
   *Her doku tipine uygundur.
   *Dayanıklı bıçak ağzı vardır.

Mikrotom Çeşitleri ve Kullanım Alanları

1. El Mikrotom
   
   *Botanik kesitlerle sınırlıdır.
   *Hayvan dokularından ince kesit zor alınır.
2. Rotary Mikrotom
   
   *Işık mikroskobu için ince ve seri kesit alınabilir.
   *Kesit kalınlığı 0.5-60 mikrondur.
   *Blok hareket edilebilir, bıçak sabit özelliklidir.
   *Glikol metakrilat ve parafine gömülü doku kesitlerinde uygundur.
3. Kızaklı Mikrotom
   
   *Tüm doku tipi, boyutu ve sertliği için uygundur
   *Blok sabit ve bıçak hareketlidir.
   *Selloidin ve büyük parafin bloklarda tercih edilir.
4. Dondurucu Mikrotom (Freezing Mikrotom)
   
   *Taze, dondurulmuş doku kesitinde kullanılan bir mikrotomdur.
   *Doku sabit,bıçaklı hareketlidir.
   *Mikrotoma adapte termomodül veya sıvı karbon dioksit taşıyıcı sistem içerir.
   *Seri kesit için uygun değildir.
   *Kalın kesit verir.
5. Kriyostat (Frozen Cihazı)
   
   *Soğuk alan içerisine yerleştirilmiş rotary mikrotom vardır.
   *İnce ve seri kesit verir.
   *Otomatik sterilizasyon sistemi vardır.
   *Acil cerrahi biyopsi ve özel boyama tekniklerinde kullanılır.
6. UltraMikrotom
   
   *Işık ve elektron mikroskobu için çok ince kesitler verir.
   *Çok küçük dokular (1mm ve daha küçük) için uygundur.
   *10 nanomikron'dan daha ince kesitler verir.
7. Testere Bıçaklı Mikrotom (Saw Mikrotom)
   
   *Çok sert materyallerin kesilmesinde kullanılır. (Ör: dekalsifiye olmamış kemik)
   *20 mikron ve üzeri kalınlığında kesitler verir.
8. Vibrasyonlu Bıçak Taşıyıcı Mikrotom
   
   *Taze,fikse olmamış materyallerde kullanılır.
   *Kesit esnasında bıçakta yüksek hızda vibrasyon görülür.
9. Rocking Mikrotom
   
   *Sadece parafin kesitlerde kullanılır.
   *Dokunun yay vasıtasıyla sabit bıçağa doğru hareketi ile kesitler alınır.
   *İnce kesit için uygun değildir.

Gömme ve Kesme

      Gömme materyali olarak parafin,selloidin,selloidin-parafin kullanılabilir. Amacı dokuları yarı sert ve kolayca kesebilen bir materyal içerisine yerleştirmektir. Böylece kolay taşınan ve parçanın istenilen yönde kesilmesini sağlayan bloklar elde edilir. Parafinin erime derecesi 45-50 C olan yumuşaktır ,55- 60 C olan ise daha sert parafindir. Parafin seçimi çalışma ortamının ortalama ısısına , gömülecek materyalin yapısına ve istenilen kesit kalınlığına bağlıdır.

         Kesme: Mikrotom denilen aletle doku parçasını içeren parafin bloklarından 5-10 mikron kalınlıklarında kesitler alınır. Bunun için mikrotomda kullanılan bıçağın çok keskin olması ve uygun açıda kullanılması şarttır. Kesitler, jelatin solüsyonu ihtiva eden 40-50 Clik su banyosuna atılır. Jelatin, kesitlerin lamlara yapışmasına yardım eder. Böylece su banyosuna atılan kesitler ısının tesiri ile açılırlar. Sonra birer birer lamlara alınarak kurumaya terkedilirler. 

Tespit' in diğer Ajanları ve Hazırlanışları

• Zenker Fiksatifi : Asetik asitsiz stok solusyon iyi korunur. Zenker etkili bir mikro-anatomik fiksatiftir ve özellikle sitoplazmik ve fibril boyaları üzerine çok yararlı etkisinden dolayı kullanılmaktadır.
  
  Merkürid klorid           5 gr
  Potasyum dikromat      2,5 gr
  Sodyum Sülfat             1 gr
  Distile su                      100 cc
  Asetik asit                    5 cc
  
• Bouin Fiksatifi : Eritrositlerin kısmen veya tamamen lizisine yol açar ve kollajen fibrilleri şişebilir. Aşırı sertleşmeye yol açmaz. Sitoplazmik boyalarda parlak boyanma sağlar. Glikojeni çok iyi korur.
  
  Suda doyurulmuş pikrik asit      75 cc
  Formalin                                  25 cc
  Asetik asit                                5 cc
  
• Carnoy Fiksatifi : Hızla penetre olan ve hareket eden bir fiksatiftir. Kromozom çalışmaları için kullanılır fakat eritrositlerin lizisine ve fazla büzülmeye yol açar. Glikojeni korur fakat bazı sitoplazmik granüller çözünebilir.
  
  Absolü alkol       60 cc
  Kloroform          30 cc
  Asetik asit          10 cc
  
• Sanfelice Fiksatifi : Mitotik figürler ve kromozomlar için mükemmel bir fiksatiftir.
  
  Çözelti A                                     Çözelti B
  Formalin       128 cc                      %1 lik kromik asit     100 cc
  Asetik asit     16 cc
  
• Fleming Fiksatifi : Formalin fiksasyonunu takip eden ikinci fiksatif olarak kullanarak miyelini başarılı şekilde göstermekte kullanılır.
  
  %1 lik kromik asit       15 cc
  %22 lik OSO4            4cc
  Asetik asit                   1 cc
  
• Orth Fiksatifi : Mitokondri gibi sitolojik yapılar üzerine ve kromaffin reaksiyonundaki mordontlama özelliği nedeni ile çok yararlıdır.
  
  Formalin            10cc
  Müller sıvısı       100 cc
  
• Susa Fiksatifi : Biyopsi materyalleri için uygun bir fiksatiftir.
  
  Merkürid Klorid        45gr
  Sodyum Klorid          5 gr
  Trikloroasetik asit      20 gr
  Asetik asit                 40 cc
  Formalin                    200 cc
  Distile su                    800 cc

Tespit işleminde kullanılan Ajanlar (Kimyasallar)

1) Sıvı Tespit Ajanları

• Absolu Alkol : 78 C de kaynayan,renksiz, tutuşabilen bir sıvıdır. Glikojeni iyi korur ancak .ekirdek detayının kaybına ve sitoplazmanın büzülmesine neden olur.
• Soğuk aseton: Özellikle lipazlar ve fosfatazlar gibi enzimlerin histokimyasal çalışmalarında tercih edilir. Rutin fiksatif olarak kullanılmaz. Çekirdek detayının kaybına ve sitoplazmanın büzülmesine neden olur. Glikojeni iyi korumaz.
• FORMALDEHİT : Ağırlığının %40 ı kadar suda çözünebilen bir gazdır ve formaldehit %40 veya formalin adı altında satılmaktadır. Proteinleri precipite etmez ve diğer hücre bileşenleri ise kısmen precipite eder. Albümini sertleştirmez ve çözünür halde tutar ve sonraki dehidratasyonda alkollerle sertleşmeyi engeller. Formalin yağları ne korur ne de haraplar. Kompleks lipidler için iyi bir fiksatiftir fakat nötral lipidler üzerine etkisi yoktur. Formalin karbonhidratlar için seçilen bir fiksatif olmamasına rağmen glikojeni kolaylıkla çözünmesini engelleyerek korur. Frozen kesitler için ideal bir fiksatiftir. Solüsyonun nötralizasyonu arzu edilir. Tampon tuzları nötralizasyon sağlanabilir. Konsantre asit formalin sonuçta çıkan CO2 in laboratuvarda ciddi patlamalara yol açtığından Mg veya CaCO3 ile muamele edilmemelidir. Kalsiyum karbonat dokularda pseudokalsifikasyon oluşturabilir. Konsantre formalin solüsyonu bazen paraformaldehit oluşumu nedeni ile bulanıklaşır, solusyonun gücü azalır. Fakat filtre edilirse kullanılabilir. Formalin renksiz olmalıdır. Sarı solusyonlar kullanılan demir kaptan kaynaklanan demir iyonları ile kontamine olmuştur. Demir içeren formalinle fikse edilen dokuların kesitleri pozitif prusya mavisi reaksiyonu verir ve kontamine olacağı düşünülen formalin örnekleri aynı yöntemle test edilebilir. Formalini konsantre solusyon olarak kullanmak uygun değildir ve çeşme suyuyla serum fizyolojik ile veya tampon tuz solusyonları ile yaygın olarak %10 luk olarak seyreltilir. Bu solusyonlar %4 oranında formaldehit içermektedir. Formalin, özellikle bazı kişilerde gözlere, solunum epiteli iridasyonuna yol açan istenmeyen bir duman çıkarır. Bu nedenle formalinle tespit edilen dokuların diseksiyonu için iyi havalandırılan oda kullanılmalıdır.
• Gluter Aldehit : Formaldehitten daha yavaş penetre olur. Elektron mikroskopi ve enzim histokimyası için çok yararlıdır. Fikse edilen örnekler solüsyonda aylarca kalabilir. Bu ajanla tespit edilen kesitler Pas+ reaksiyon vermeye yatkınlardır. Formaline göre daha pahalıdır.
• Trikloro Asetik Asit : Günümüzde kullanılmaktadır. Sistin, sistein ve metionin gibi sülfür grubu amino asitleri iyi korur. Dekalsifiye ajanı olarak kullanılmaktadır.
• Asetik Asit : Tek olarak kullanılmaz. Hızlı ve iyi penetre olur ancak eritrositlerin lizisine yol açar. Kollajen fibrilleri şişirir, nukleoproteinleri precipite eder ve bazı sitoplazmik granüller üzerine çözücü bir etkiye sahiptir.

 2) Katı Tespit Ajanları

• Civa Klorür (HgCl2) : Kuvvetli bir protein precipitantıdır. Dokuya hızla penetre olur ve dokuyu sertleştirir. Dokuyu büzer fakat eğri büğrü etmez. Hem nukleusu hem de sitoplazmayı iyi fikse eder. Çekirdeğin özellikle sitoplazmanın asit boyalarla boyanmasını sağlar.
• Potasyum Dikromat : Potasyum dikromat solusyonlarının pH'sı fiksasyonu önemli ölçüde etkiler. pH 3.4-3.8 arasında sitoplazma homojen olarak ve mitokondriler fikse olurken, nukleoproteinler korunamazlar. Daha asidik olduğunda ise kromik asit gibi davranır; hem nukleus hem sitoplazma mitokondri harabiyeti ile birlikte precipite olur.
• Kromik Asit : Anhidritin (Cr03) in koyu kırmızı kristallerini distile suda çözerek hazırlanır. %2 lik solusyon fiksatiflerin hazırlanması için uygundur. Proteinleri precipite eder ve karbonhidratları tespitler. Kuvvetli bir oksitleyici ajan olarak genel olarak alkol veya formalinle karıştırılmamalıdır.Kromik asitle fiksasyondan sonra dokular alkolle muamele edilmeden önce akarsuda yıkanmalıdır. Böyle yapılmazsa dokularda çözünemez precipat oluşumuyla sonuçlanabilir.
• Pikrik Asit : Parlak sarı kristalin bir maddedir. Isıtılırsa patlayıcı özelliği vardır. Nukleoproteinleri precipite eder ve biraz büzer fakat hafif sertleştirir. Sitoplazmik boyalarla zenginleştirir ve glikojen için kullanılan fiksatiflerin faydalı bir elemanıdır. Pikrik asit fiksasyonundan sonra dokular direkt olarak alkole alınır.
• Osmiyum Tetroksit : Diğer adı osmik asittir. Oldukça pahalı bir kimyasaldır. Hem kristalin hemde çözeltinin dumanı iridanttır ve tehlikelidir. Kullanım alanı azdır.

Tespit aşamasında dikkat edilmesi gerekenler

 1) Tespit sıvısının amaca göre seçimi

 2) Tespit sıvısının miktarı
   
     * Normal de 1:50- 1:100 oranı bildirilmektedir.
     * Kimyasal madde yönünden olanakları sınırlı durumdaki laboratuvarlar için 1:20- 1:25 oranı ile de uygun sonuç alınabileceğini belirtmekte yararı vardır.
     * Bu kurala uymayan tek ayrıcalık ozmik asit'tir. 1:5 oranı uygundur.

 3) Tespit sıvısının pH'ı

     * pH asit olduğunda: çekirdek sitoplazmaya göre daha iyi korunur.
     * pH alkali olduğunda ise sitoplazma daha iyi korunur.
     * Asit pH'den en çok etkilenen sitoplazmik oluşumlar ise mitokondriyon'lardır.
     * Bu konuda değişik araştırmacılar farklı görüşler ileri sürmektedirler. Bir kısmı kan serumu gibi vucut sıvılarındaki pH 7,2 çalışmayı önerirken, diğer bir kısmı da pH 4' ü önermektedirler.

 4) Tespit süresi

    * Parçanın büyüklüğüne
    * Tespit sıvısının difüzyon gücüne
    * Ortamın ısısına
    * Amaca
    * Parçanın cinsine göre değişiklik gösterir.

Otoliz

    Hücrelerin ölümünden sonra intraselüler enzimlerin hareketinin değişmesi ile protein yıkımına ve sonuçta hücrelerin sıvı hale gelmesine yol açar. Otolitik değişiklikler herhangi bir bakteriyel hareketten bağımsızdırlar, soğukta gecikirler, 37 C de muhafaza etmek önemli ölçüde hızlandırır. Doku 57 C'ye ısıtılırsa hemen hemen tamaman inhibe edilir. Kimi organlarda otoliz çok seri şekillenir. Örneğin; ölümden 15 dakika sonra alınan böbrek parçalarında oldukça büyük değişikliklerin şekillendiği görülür. Ancak 0 C'de tutulduğunda bu değişikliklerin daha geç şekillendiğide bir gerçektir.  Otoliz; beyin, böbrek gibi çok iyi özelleşmiş organları, elastik fibriller, kollajen gibi yapılardan daha hızlı ve ciddi olarak etkilemektedir.

   Mikroskobik incelemede otoliz olmuş dokunun hücre çekirdekleri kondensasyon (piknoz), fragmentasyon (karyoreksis),lizis veya görülmeme (karyolizis) gösterebilir. Sitoplazma şişmiş ve granüler hale gelebilir ve tüm doku sonradan boyama reaksiyonunda kayıp veya büyük değişimle granüler ve homojenöz kütle haline dönüşür. Otoliz, epitelin dökülmesine, hücrelerin bazal membrandan ayrılmasına yol açar. Ek olarak teşhis önemi olan maddeler (glikojen) miktarca azalır ve uygun fiksasyonun olmayışından dokuya yayılırlar.

 Bakterilerin dokularda yol açtıkları değişiklikler otoliz dekine çok büyük benzerlik gösterir ve ölüm sırasında (septisemi gibi) hasta dokudaki veya yaşamda vücutta normalde bulunan ( Örneğin barsak flora bakterileri gibi) non-patojenik organizmaların çoğalmasıyla meydana gelmektedir. Fiksatifler dokuda mevcut olan veya ölümden sonra meydana gelen ve dokunun daha ileri değişimlerine yol açan bütün bakterileri öldürür.

Tespitin Amaçları (Fiksasyon)

• Otolizi ve bakteriyel bozulma ve çürümeyi önlemek veya durdurmak
• Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek
• Kesit hazırlama basamaklarındaki sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek (Dehidrasyon,şeffaflandırma,parafine gömme)
• Dokuyu boyalarla ve diğer reaktiflerle diferansiyel boyamayı kolaylaştıran bir duruma getirmek.

Tespit nedir? (Fiksasyon)

     Hücreleri, yaşamın durduğu andaki yapısal durumlarıyla sabitleştirmektir. Bir insan ve hayvan ölür ölmez hücreleri ve dokuları çeşitli katabolik enzimleri kapsadığı için yavaş yavaş otoliz (kendi kendini çözme) sebebiyle değişikliklere uğrar. Buna postmortem (ölüm sonrası) dejenerasyon denir. Aynı değişiklikler operasyonla alınan canlı doku parçalarında da görünür.

   Fiksasyonun amacı hücrelerin ve doku elemanlarının canlı hale yakın bir konumda muhafaza etmektir. Bir anlamda da konserve yapımına ya da mumyalaştırmaya benzer nitelik taşır. Bilindiği gibi, bütünlüğü bozulan ve organizma dışına çıkartılan dokular özel koşullar sağlanmadığı taktirde kısa sürede değişime, yıkıma uğrarlar. Bu yıkımda görevli olan organeller lizozomlardır. Canlı organizmanın hücrelerinde lizozomlarda, sitosol'den lizozomlara doğru bir ozmotik yönlendirme vardır. Buna bağlı olarak da lizozomlardaki hidrolitik enzimler sitolosol 'e geçmezler. Ancak, patolojik koşullarda membran geçirgenliği arttığında sitosol'e geçen enzimler hücrede bozukluklara neden olurlar. Ölü hücreler, canlıdakinin tamamen tersi bir ozmotik durum gösterirler. Bireyde ya da hücrede ölüm olayı sonrasında membran, kontrol gücünü yitirir ve sitosol 'e çıkan lizozom enzimleri otoliz'e neden olurlar. Bu yüzden , hücrelerde henüz yıkım olayları olmadan, alınan doku ya da organ parçalarına tespit işlemi uygulanır. Buradan da anlaşılacağı gibi tespit, hücreleri yaşam sırasındaki (in vivo) durumlarıyla saklamaktadır. Böylece hücreler değişime uğramaksızın korunurlar ve incelenebilirler.

Histoloji tekniğindeki temel aşamalar

 1) Tespit ( Fixation)

 2) Yıkama (Rinsing)

 3) Suyunu giderme (Dehydration)

 4) Saydamlaştırma ( Clearing with xylene)

 5) Emdirme ( With paraffine)

 6) Gömme ve ya blokaj (Paraffin embedding)

 7) Kesme (Sectioning with microtome)

 8) Boyama (Staining to cells)

 9) Kapatma (Mounting with balsam)

Histoloji

         Dokuları inceleyen bir bilim dalıdır. Dokuların yapısının araştırılması yanısıra ikincil olarak tek tek hücrelerin ayrıntılı yapısınıda araştırır. Histoloji ve sitoloji birbirleri ile yakın ilişkilidir. Canlı dokuların mikroskobik incelemesi ile ideal sonuçlara ulaşılır. Ancak sadece küçük ilkel canlılar bu yolla incelenebilir. Dokuların çoğu bu yolla incelenemeyecek kadar kalındır. Histolojik tekniklerin çoğu canlı dokuya en yakın bir biçimde korunmuş veya fikse edilmiş öldürülmüş dokulara uygulanır. 
     
        Ölü dokulardan hazırlanan histolojik preparatların canlı dokulardan daha farklı olduğunu unutmamak gerekir. Bu değişiklikler artifakt olarak adlandırılır. Artifaktlar herhangi bir işlem basamağında ortaya çıkabilir.  Dokuda en az hasara yol açacak yöntemler kullanılmalıdır.

        Sitolojik ve histolojik çalışmalardaki amaç, organizmayı oluşturan hücre, doku ve organların normale yakın bir şekilde morfolojik olarak mikroskop altında incelenmesidir. Bu da ancak histolojik ve histokimyasal teknikler sayesinde olabilmektedir. Histokimya 1830'dan bu yana ayrı bir bilim dalı olarak gelişmiştir. Ancak 1899-1928 yıllarında anilin boyaların histolojide kullanılmaya başlamasıyla büyük bir atılım olmuştur.

       Preparat hazırlamak için çok teknik vardır. Bunların çoğu değişik tip mikroskoplarda incelenen kesitlerin hazırlanması ile ilgilidir. Tek bir yöntem tek bir boyama yöntemi dokunun ne tüm hücrelerini ne de hücre bileşenlerini ayrıntılı gösteremez. Çok az bir doku örneğinin boyanması ile morfoloji, histokimyasal ve immünolojik yöntemlerle fonksiyonel özellikleri, elektronmikroskopi ile de ince yapı gösterilebilir.

      Histologlar, tekniğin neden kullanıldığını, nasıl çalıştığını ve yöntemin ayrıntılarını bilmelidir. Uygun zaman içinde, dokudan mümkün olan en fazla bilgi edinilmelidir. Teknikler dikkat ve beceri ile uygulanmalı sonuçlar doğru yorumlanmalıdır.